The perbezaan utama antara penjujukan Sanger dan pyrosequencing ialah Penjujukan penjujukan adalah pendekatan penjujukan DNA yang menggunakan kaedah penamatan rantai dideoksi, sedangkan pyrosequencing adalah pendekatan penjujukan DNA berdasarkan prinsip penjujukan-demi-sintesis. Oleh itu, dalam penjujukan Sanger, pengenalpastian nukleotida dilakukan dengan elektroforesis kapilari setelah penguatan serpihan DNA keseluruhan semasa dalam pyrosequencing, pengenalan nukleotida dilakukan dengan pembebasan pirofosfat semasa sintesis.

Penjujukan dan pyrosequencing adalah dua kaedah penjujukan DNA; yang pertama adalah 'standard emas' untuk kebanyakan sasaran sementara yang terakhir adalah alternatif pertama untuk kaedah penjujukan Sanger konvensional.

Penjujukan DNA, PCR, Pirofosfat, Pyrosequencing, Penjujukan Sanger, Sensitiviti

Apakah Penjujukan Sanger

Penjujukan penjujukan adalah kaedah penjujukan DNA generasi pertama yang dikembangkan oleh Fredric Sanger pada tahun 1977. Selain itu, asas penjujukan Sanger adalah kaedah penamatan rantai dideoxy.

Urutan Sanger - Prosedur

Dalam penjujukan Sanger, polimerase DNA bertanggungjawab untuk penggabungan selektif dideoxynucleotides (ddNTPs) yang berakhir dengan rantai semasa sintesis DNA in vitro. Oleh itu, dideoxynucleotides (ddNTPs) dilabelkan neon ke dalam amplicon oleh PCR. Di sini, ddATP dilabelkan dengan pewarna hijau; ddGTP dilabelkan dengan pewarna kuning; ddCTP dilabel dengan warna biru, dan ddTTP dilabelkan dengan pewarna merah) Kemudian, amplikon yang dihasilkan dipisahkan dengan elektroforesis kapilari sambil mengesan nukleotida berlabel pendarfluor.

Gambar 1: Kaedah Penjujukan Sanger

Penjujukan Sanger - Kepentingan

Walau bagaimanapun, kaedah penjujukan Sanger mempunyai beberapa batasan termasuk ketidakmampuan untuk memproses output penjujukan yang lebih lama, analisis selari dengan sampel yang lebih sedikit, ketidakmampuan automasi total penyediaan sampel, kos yang lebih tinggi, kesilapan penjujukan, kurang kepekaan (10-20%), iaitu tidak mencukupi untuk mengesan alel mutan tahap rendah, dan lain-lain. Walaupun terdapat had ini, ini adalah 'standard emas' untuk penjujukan dalam banyak prosedur klinikal.

Apa itu Pyrosequencing

Pyrosequencing adalah alternatif pertama untuk penjujukan Sanger konvensional. Ini adalah sejenis penjujukan generasi seterusnya yang dikembangkan di Royal Institute of Technology (KTH). Lebih-lebih lagi, kaedah ini didasarkan pada pengesanan luminometrik pirofosfat (PPi) yang dikeluarkan semasa penggabungan nukleotida pemangkin DNA polimerase yang diarahkan primer.

Pyrosequencing - Prosedur

Secara amnya, empat enzim digunakan dalam kaedah ini untuk mengesan nukleotida yang digabungkan secara tepat. Mereka adalah DNA polimerase, ATP sulfurylase, luciferase, dan apyrase. Lebih-lebih lagi, primer penjujukan dihibridisasi ke templat berlabel biotin DNA helai tunggal. Selain itu, empat deoksinukleotida trifosfat (dNTP), adenosin 5 'fosfosulfat (APS) dan luciferin adalah substrat dalam campuran tindak balas.

Gambar 2: Kaedah Pyrosequencing

Apabila lata pempolimeran dimulakan, PPi anorganik melepaskan sebagai hasil penggabungan nukleotida oleh polimerase. Walau bagaimanapun, kuantiti PPi yang dilepaskan adalah sama dengan jumlah nukleotida yang digabungkan dalam setiap kitaran. Selepas itu, ATP sulfurylase menukar PPi yang dilepaskan menjadi ATP di hadapan APS secara kuantitatif. ATP yang dihasilkan mendorong penukaran luciferin menjadi oksiluciferin yang dimediasi oleh enzim luciferase. Juga, tindak balas ini menghasilkan cahaya yang dapat dilihat dengan jumlah ATP. Kemudian, cahaya ini dapat dikesan pada panjang gelombang 560 nm.

Pyrosequencing - Kepentingan

Persamaan Antara Penjujukan Sanger dan Pyrosequencing

Perbezaan Antara Penjujukan Sanger dan Pyrosequencing

Definisi

Penjujukan penjujukan merujuk kepada kaedah penjujukan DNA dengan penggabungan selektif dari dideoksynukleotida penghentian rantai, sementara pyrosequencing merujuk kepada kaedah penjujukan DNA berdasarkan prinsip penjujukan-demi-sintesis.

Jenis Urutan

Penjujukan penjujukan adalah pendekatan penjujukan generasi pertama, sementara pyrosequencing adalah kimia penjujukan generasi seterusnya, yang merupakan pendekatan penjujukan generasi kedua.

Korelasi

Penciptaan

Frederick Sanger dan rakan-rakannya adalah yang pertama mengembangkan urutan Sanger pada tahun 1977 sementara Pål Nyrén dan muridnya Mostafa Ronaghi adalah yang pertama mengembangkan pyrosequencing, di Royal Institute of Technology di Stockholm pada tahun 1996.

Pengkomersialan

Walaupun penjujukan Sanger pertama kali dikomersialkan oleh Applied Biosystems, pyrosequencing digunakan di platform Roche 454 dan GS FLX Titanium.

Prinsip

Di atas segalanya, perbezaan utama antara penjujukan Sanger dan pyrosequencing adalah bahawa penjujukan Sanger menggunakan kaedah penamatan rantai dideoxy, sementara pyrosequencing didasarkan pada prinsip penjujukan-oleh-sintesis.

Pengenalpastian Nukleotida

Dalam penjujukan Sanger, pengenalpastian nukleotida dilakukan dengan elektroforesis kapilari setelah penguatan keseluruhan fragmen DNA semasa dalam pyrosequencing, pengenalan nukleotida dilakukan dengan pembebasan pirofosfat semasa sintesis.

Pengesanan

Selanjutnya, penjujukan Sanger melibatkan pengesanan cahaya pendarfluor, sementara pyrosequencing melibatkan pengesanan cahaya yang dapat dilihat pada 560 nm.

Panjang Pecahan DNA

Selain itu, penjujukan Sanger dapat membaca hingga 800 hingga 1000 pasangan asas sementara pyrosequencing dapat membaca hingga 300-500 pasangan asas.

Kepentingan

Penjujukan urutan Sanger adalah proses yang kompleks dengan banyak langkah, sementara pyrosequencing adalah proses yang kurang kompleks dengan langkah yang lebih sedikit.

Kepekaan

Juga, satu lagi perbezaan antara penjujukan Sanger dan pyrosequencing adalah bahawa penjujukan Sanger mempunyai kepekaan yang lebih rendah, sementara urutan pyrosequencing mempunyai kepekaan yang lebih tinggi.

Kesimpulannya

Penjujukan penjujukan adalah pendekatan penjujukan generasi pertama, yang merupakan kaedah penjujukan penjujukan. Juga, ini adalah 'standard emas' untuk banyak sasaran. Walau bagaimanapun, ia menggunakan kaedah penamatan rantai dideoxy diikuti dengan elektroforesis kapilari. Sebaliknya, pyrosequencing adalah alternatif pertama untuk penjujukan Sanger, dan ia adalah sejenis penjujukan generasi seterusnya. Selanjutnya, ia mempunyai kepekaan yang lebih tinggi dan lebih sedikit langkah untuk dilindungi. Secara amnya, ia menggunakan kaedah penjujukan mengikut sintesis, yang menentukan nukleotida semasa sintesis serpihan DNA sebagaimana adanya. Oleh itu, perbezaan utama antara penjujukan Sanger dan pyrosequencing adalah kaedah penjujukan dan faedahnya.

Rujukan:

1. Fakruddin, Md, dan Abhijit Chowdhury. "Pyrosequencing-Alternatif untuk Urutan Sanger Tradisional." American Journal of Biochemistry and Biotechnology, vol. 8, tidak. 1, 2012, hlm. 14–20., Doi: 10.3844 / ajbbsp.2012.14.20.

Gambar Kesopanan:

1. "Sanger-sequencing" Oleh Estevezj - Karya sendiri (CC BY-SA 3.0) melalui Commons Wikimedia 2. "How Pyrosequencing Works" Oleh "Jacopo Pompilii, DensityDesign Research Lab". - Karya sendiri (CC BY-SA 4.0) melalui Wikimedia Commons