Perbezaan Utama - PCR vs RT-PCR

PCR dan RT-PCR adalah dua teknik penting dalam biologi molekul. PCR dikembangkan oleh Kary Mullis pada tahun 1980-an. Ia mampu meningkatkan jumlah salinan gen tertentu secara eksponensial, memudahkan pengesanan serpihan DNA tertentu. Taq Polymerase adalah enzim yang paling sering digunakan dalam sistem PCR. Ia adalah enzim termostabil. Dalam RT-PCR, transkripsi terbalik diikuti oleh PCR. Enzim, transkripase terbalik terlibat dalam sintesis DNA pelengkap dari RNA. The perbezaan utama antara PCR dan RT-PCR adalah bahawa PCR menggunakan DNA untai dua sebagai templat sedangkan RT-PCR menggunakan RNA sebagai templat.

Kawasan Utama Dilindungi

1. Apa itu PCR - Definisi, Proses, Aplikasi 2. Apakah RT PCR - Definisi, Ciri, Aplikasi 3. Apakah perbezaan antara PCR dan RT PCR - Perbandingan Perbezaan Utama

Syarat Utama: PCR, RT-PCR, Reaksi Rantai Polimerase, Reaksi Transkripsi Terbalik-Rantai Polimerase, Templat DNA, Polimerase DNA, Denaturasi, Penyepuhan, Penyebaran Primer

Apa itu PCR

PCR (Tindak balas Rantai Polimerase) adalah kaedah yang agak mudah tetapi revolusioner. PCR menggunakan kemampuan enzim, DNA polimerase untuk mensintesis helai DNA baru dengan cara pelengkap kepada helai templat yang ditawarkan. PCR adalah teknik yang sangat diperlukan yang digunakan di makmal klinikal dan penyelidikan untuk analisis fungsional gen, diagnosis, dan pemantauan penyakit keturunan, pengklonan DNA, penjujukan, dan penguatan DNA kuno. Templat DNA, nukleotida, primer, dan polimerase DNA adalah empat komponen utama PCR. The Templat DNA biasanya DNA untai ganda dengan urutan sasaran, yang akan diperkuat. Taq DNA polimerase yang diasingkan dari Thermus aquatics biasanya digunakan dalam PCR. The Polimerase DNA Pfu adalah jenis polimerase DNA yang lain dengan kesetiaan yang tinggi. Kedua-dua polimerase Taq dan Pfu tahan panas. Nukleotida yang ditambahkan oleh polimerase DNA adalah adenin (A), guanin (G), sitosin (C), dan timin (T). Oleh kerana polimerase DNA hanya dapat menambahkan nukleotida baru ke ujung 3 str untai DNA yang sudah ada, primer oligonukleotida diperlukan untuk permulaan sintesis DNA. Keperluan primer dalam PCR membolehkan menggambarkan hanya kawasan tertentu dalam templat. Urutan sasaran diapit oleh primer depan dan belakang. Pada akhir PCR, salinan baru yang disebut amplicon dari urutan DNA tertentu dikumpulkan dalam berbilion-bilion. Komponen PCR harus dioptimumkan sedemikian rupa untuk meningkatkan prestasi PCR sambil meminimumkan kegagalan.

PCR adalah proses automatik yang dilakukan oleh pengendara terma, yang mampu beralih antara suhu yang berbeza. PCR adalah proses tiga langkah.

1. Penolakan - Templat DNA dua helai dipisahkan menjadi dua helai tunggal dengan memanaskan hingga 94-95 ° C.
2. Meluruskan - Primer depan dan belakang mengikat pada urutan pelengkap dalam templat. Suhu langkah ini bergantung pada suhu lebur kombinasi primer.
3. Sambungan primer - Enzim DNA polimerase memanjangkan setiap primer pada 3'end dengan menambahkan asas pelengkap pada helai yang tumbuh. Suhu optimum Taq polymerase, 72 ° C digunakan sebagai suhu pada langkah pemanjangan. Masa peluasan bergantung pada bilangan pasangan asas dalam helai templat.

Ketiga-tiga langkah diulang selama 28-35 kali.

Rajah 1: Tindak balas Rantai Polimerase

Produk PCR difraksinasi ukuran oleh elektroforesis gel agarosa dibandingkan dengan tangga DNA. Visualisasi DNA pada gel agarosa dilakukan dengan pewarnaan dengan etidium bromida dan pemerhatian di bawah UV. Jalur DNA yang diperkuat di bawah UV dalam gel berwarna etidium bromida ditunjukkan pada gambar 2. Tangga DNA ditunjukkan di telaga paling kiri.

Rajah 2: Jalur DNA

Apa itu RT-PCR

RT-PCR (Reaksi rantai transkripsi-polimerase terbalik) adalah salah satu teknik yang paling sensitif yang digunakan untuk mengesan mRNA. RNA adalah templat yang sesuai untuk mengumpulkan maklumat sama ada mengenai ekspresi gen tisu normal atau ekspresi gen tisu yang dijangkiti. Templat untuk RT-PCR boleh berupa RNA total atau RNA virus atau bakteria masing-masing. RNA ditranskripsikan balik menjadi DNA pelengkap (cDNA) oleh enzim, transkripase terbalik. Suhu optimum transkripase terbalik ialah 46 ° C. CDNA digunakan dalam PCR untuk mendapatkan produk. Langkah-langkah dalam PCR transkripsi terbalik ditunjukkan pada gambar 3.

Gambar 3: RT-PCR

RT-PCR dapat dilakukan dalam reaksi dua langkah atau satu langkah. Dalam reaksi dua langkah, transkripsi terbalik dan PCR dilakukan dalam dua langkah yang berasingan. Dalam RT-PCR satu langkah, transkripsi terbalik diikuti oleh PCR dalam satu tiub secara berurutan. Kedua-dua produk cDNA dan PCR akhir dapat dijalankan pada gel agarose untuk tujuan pecahan dan visualisasi. RT-PCR satu langkah dan dua langkah ditunjukkan pada gambar 4.

Gambar 4: RT-PCR satu langkah dan dua langkah

Perbezaan Antara PCR dan RT-PCR

Definisi

PCR: PCR adalah teknik yang digunakan dalam biologi molekul untuk memperkuat segmen DNA yang menghasilkan berjuta-juta salinan urutan DNA.

RT-PCR: RT-PCR adalah varian PCR yang digunakan dalam pengesanan ekspresi gen dalam biologi molekul.

Langkah-langkah

PCR: Denaturasi, penyepuhlindapan, dan peluasan adalah tiga langkah dalam PCR.

RT-PCR: Dalam RT-PCR, transkripsi terbalik diikuti oleh PCR.

Templat

PCR: Molekul DNA untai dua berfungsi sebagai templat untuk PCR.

RT-PCR: Molekul RNA untai tunggal berfungsi sebagai templat untuk transkripsi terbalik. Molekul DNA sehelai helai berfungsi sebagai templat untuk PCR.

Enzim Digunakan

PCR: DNA polimerase digunakan sebagai enzim dalam PCR.

RT-PCR: Transkripase terbalik dan polimerase DNA digunakan sebagai enzim dalam RT-PCR.

Primer

PCR: Primer hadapan dan terbalik digunakan dalam PCR.

RT-PCR: Hanya primer terbalik yang digunakan untuk transkripsi terbalik dan kedua primer depan dan terbalik digunakan dalam PCR.

Kepekaan

PCR: PCR adalah kaedah sensitif.

RT-PCR: RT-PCR lebih sensitif bahawa PCR.

Permohonan

PCR: PCR digunakan dalam analisis fungsional gen, diagnosis, dan pemantauan penyakit keturunan, pengklonan DNA, penjujukan DNA, dan penguatan DNA kuno.

RT-PCR: RT-PCR digunakan dalam pengesanan ekspresi gen.

Kesimpulannya

PCR dan RT-PCR adalah dua teknik penting yang digunakan dalam biologi molekul. Kedua-dua PCR dan RT-PCR adalah teknik automatik yang mampu meningkatkan jumlah salinan urutan DNA sasaran secara eksponensial, yang ditentukan oleh primer maju dan mundur. Dalam PCR, DNA untai ganda digunakan sebagai templat. Dengan PCR, pengklonan DNA, penjujukan DNA, dan analisis fungsi gen dapat dilakukan. Dalam RT-PCR, ekspresi gen dalam tisu tertentu dapat diperhatikan dengan menguatkan RNA. Perbezaan utama antara PCR dan RT-PCR adalah pada templatnya yang digunakan dalam setiap reaksi dan aplikasinya.

Rujukan:

1. "Reaksi Rantai Polimerase (PCR)." Pusat Maklumat Nasional Bioteknologi. Perpustakaan Perubatan Nasional A.S., n.d. Web. Terdapat di sini. 01 Jun 2017. 2. "Reaksi Rantai Polimerase (atau PCR)." Pengklonan dan Analisis Molekul Gen. N.p., n.d. Web. Terdapat di sini. 01 Jun 2017. 3. Biolabs, New England. "Sintesis CDNA & RT-PCR." Sintesis CDNA & RT-PCR | NEB. N.p., n.d. Web. Terdapat di sini. 01 Jun 2017.

Gambar Kesopanan:

1. "Reaksi rantai polimerase" Oleh Enzoklop - Karya sendiri (CC BY-SA 3.0) melalui Commons Wikimedia 2. "DNA fragmendid etiidiumbromiidiga värvitud agaroosgeelis." Oleh Rainis Venta - Karya sendiri (CC BY-SA 3.0) melalui Commons Wikimedia 3. "Reaksi rantai transkripsi polimerase terbalik" Oleh Jpark623 - Karya sendiri (CC BY-SA 3.0) melalui Commons Wikimedia 4. "Satu langkah vs dua langkah RT-PCR ”Oleh Jpark623 - Karya sendiri (CC BY-SA 3.0) melalui Wikimedia Commons