Perbezaan Utama - PCR vs QPCR

PCR (reaksi berantai polimerase) dan qPCR (PCR kuantitatif) adalah dua teknik yang digunakan dalam bioteknologi untuk memperkuat DNA untuk pelbagai tujuan. PCR adalah teknik yang agak mudah. qPCR juga dikenali sebagai PCR masa nyata atau PCR digital. The perbezaan utama antara PCR dan qPCR adalah bahawa PCR adalah teknik kualitatif sedangkan qPCR adalah teknik kuantitatif. PCR membolehkan membaca hasilnya sebagai "kehadiran atau ketiadaan". Tetapi dalam qPCR, jumlah DNA yang diperkuat dalam setiap kitaran dihitung. Jika RNA digunakan dalam PCR, teknik ini dikenal sebagai RT-PCR (PCR transkripsi terbalik), dan jika RNA digunakan dalam qPCR, teknik ini dikenal sebagai qRT-PC.

Kawasan Utama Dilindungi

1. Apa itu PCR - Definisi, Proses, Kegunaan 2. Apa itu QPCR - Definisi, Proses, Kegunaan 3. Apakah Persamaan Antara PCR dan QPCR - Garis Besar Ciri Umum 4. Apakah Perbezaan Antara PCR dan QPCR - Perbandingan Perbezaan Utama

Syarat Utama: Elektroforesis Gel Agarosa, Amplikon, polimerase DNA, Pewarna Fluoresen, PCR, Probe, qPCR, RT-qPCR

Apa itu PCR

PCR merujuk kepada teknik dalam bioteknologi yang membolehkan analisis urutan pendek DNA dengan memperkuat segmen DNA yang dipilih. Ini adalah kaedah yang sensitif kerana jumlah yang sangat kecil diperlukan oleh satu reaksi. Teknik ini berdasarkan kemampuan DNA polimerase untuk mensintesis helai DNA baru ke helai templat yang ditawarkan secara pelengkap. Campuran tindak balas PCR terdiri daripada DNA polimerase, nukleotida DNA, primer, templat DNA yang akan diperkuat, dan magnesium. Penguatan dilakukan di dalam termocycler. DNA polimerase harus tahan panas kerana suhu tinggi digunakan dalam tindak balas ini. Dua jenis polimerase DNA yang digunakan dalam PCR adalah polimerase DNA Taq dan polimerase DNA Pfu. Taq DNA polymerase banyak digunakan dalam PCR.

DNA polimerase memerlukan untaian DNA yang sudah ada pada hujung 3 to untuk mensintesis helai baru. Oleh itu, primer oligonukleotida ditambahkan ke campuran reaksi untuk permulaan sintesis DNA. Keperluan primer dalam PCR memungkinkan penguatan hanya kawasan tertentu dalam templat. Urutan sasaran diapit oleh primer depan dan belakang. Pada akhir PCR, salinan baru dari urutan DNA tertentu, yang dipanggil amplikon, terkumpul dalam berbilion-bilion. Komponen PCR harus dioptimumkan sedemikian rupa untuk meningkatkan prestasi PCR sambil meminimumkan kegagalan. Tindak balas PCR standard ditunjukkan dalam rajah 1.

Gambar 1: PCR

Langkah-langkah PCR

Tiga langkah PCR dijelaskan di bawah.

1. Penolakan - Templat DNA dua helai dipisahkan menjadi dua helai tunggal dengan memanaskan hingga 94-95 ° C.
2. Meluruskan - Primer hadapan dan terbalik mengikat urutan pelengkap dalam templat. Suhu bergantung pada suhu lebur kombinasi primer.
3. Sambungan primer - Enzim DNA polimerase memanjangkan setiap primer pada 3'end dengan menambahkan asas pelengkap pada helai yang tumbuh. Suhu optimum Taq polymerase, iaitu, 72 ° C, digunakan sebagai suhu pada langkah pemanjangan. Masa peluasan bergantung pada bilangan pasangan asas dalam helai templat.

Ketiga-tiga langkah diulang selama 28-35 kali. Elektroforesis gel agarose digunakan dalam pecahan ukuran produk PCR. Produk ini diwarnai oleh ethidium bromide dan diperhatikan di bawah UV. Produk PCR atau DNA yang diperkuat dapat digunakan dalam pengklonan, penjujukan atau genotip.

Apa itu QPCR

QPCR merujuk kepada teknik dalam bioteknologi yang memungkinkan pengesanan, pencirian, dan pengukuran asid nukleik untuk pelbagai aplikasi. Oleh itu, ia adalah jenis PCR kuantitatif. Kedua-dua DNA dan RNA dapat digunakan sebagai qPCR. Sekiranya RNA digunakan sebagai templat, pertama harus ditranskripsikan terbalik ke dalam cDNA. Oleh itu, jenis qPCR ini dikenali sebagai RT-qPCR. PCR tradisional dijalankan untuk cDNA atau sampel DNA biasa. Namun, dalam qPCR, pewarna pendarfluor digunakan untuk melabel produk PCR pada setiap langkah kitaran PCR. Ini memungkinkan pengumpulan data ketika PCR berlangsung, memungkinkan pengukuran amplicon selama fasa eksponen PCR. Jenis pewarna utama yang digunakan dalam qPCR adalah SYBR Green. Pewarna itu mengikat pada DNA helai dua. Oleh kerana pendarfluor meningkat secara berkadar dengan jumlah DNA yang diperkuat, kuantifikasi dapat dilakukan dalam "waktu nyata". Kelemahan utama penggunaan pewarna adalah kerana ia memungkinkan pengukuran satu produk tertentu dalam sampel. Selain pewarna, probe juga dapat digunakan dalam proses kuantifikasi. Probe TaqMan adalah salah satu jenis probe oligonukleotida utama yang digunakan dalam qPCR, dan proses pelepasan pendarfluor ditunjukkan pada gambar 2.

Gambar 2: Probe TaqMan

Probe boleh dirancang sedemikian rupa untuk mengesan beberapa produk PCR dalam sampel yang sama. Probe TaqMan adalah salah satu jenis probe hidrolisis utama; penggabungan probe ini ke dalam produk PCR mendedahkan fluorophore, memancarkan pendarfluor. Pewarna pendarfluor lebih khusus untuk produk PCR. Oleh itu, mereka digunakan dalam kebanyakan ujian diagnostik untuk mengesan produk PCR.

Persamaan Antara PCR dan QPCR

Perbezaan Antara PCR dan QPCR

Definisi

PCR: PCR adalah teknik dalam bioteknologi yang membolehkan analisis urutan pendek DNA dengan memperkuat segmen DNA yang dipilih.

QPCR: QPCR adalah teknik dalam bioteknologi yang memungkinkan pengesanan, pencirian, dan pengukuran asid nukleik untuk pelbagai aplikasi.

Kuantitatif / Kualitatif

PCR: PCR adalah teknik kualitatif.

QPCR: QPCR adalah teknik kuantitatif.

Pengesanan Produk

PCR: Produk dikesan oleh elektroforesis gel agarosa dalam PCR.

QPCR: Produk dapat dikesan dalam setiap siklus penguatan dalam qPCR.

Pengumpulan Data

PCR: Data dikumpulkan pada akhir tindak balas dalam PCR.

QPCR: Data dikumpulkan semasa fasa eksponen tindak balas dalam qPCR.

Resolusi

PCR: PCR mempunyai resolusi yang sangat buruk.

QPCR: QPCR mempunyai resolusi yang sangat tinggi.

Pewarna

PCR: PCR menggunakan ethidium bromide untuk mengotorkan produk semasa PCR.

QPCR: QPCR menggunakan pewarna pendarfluor untuk mengesan produk.

Masa

PCR: PCR adalah kaedah yang lebih memakan masa.

QPCR: QPCR kurang memakan masa.

RNA

PCR: RT-PCR adalah jenis PCR yang menggunakan RNA sebagai templat.

QPCR: RT-qPCR adalah jenis qPCR yang menggunakan RNA sebagai templat.

Peranan

PCR: PCR digunakan untuk mengesan kehadiran atau ketiadaan serpihan genomik tertentu.

QPCR: QPCR digunakan untuk mengukur pecahan tertentu dalam sampel.

Kesimpulannya

PCR dan qPCR adalah dua jenis teknik yang digunakan dalam bioteknologi untuk memperkuat DNA untuk pelbagai tujuan. PCR adalah kaedah penguatan tradisional yang digunakan untuk mengenal pasti kehadiran atau ketiadaan serpihan DNA. QPCR digunakan untuk mengukur pecahan tertentu dalam sampel. Oleh itu, PCR adalah teknik kualitatif sedangkan qPCR adalah teknik kuantitatif. Ini adalah perbezaan utama antara PCR dan qPCR.

Rujukan:

1. "QPCR vs Digital PCR vs Tradisional PCR." Thermo Fisher Scientific, Terdapat di sini.

Gambar Kesopanan:

1. "PCR" Oleh Madprime - Karya sendiri (CC BY-SA 3.0) melalui Wikimedia Commons2. "Taqman" Oleh Pengguna: Braindamaged - Karya sendiri oleh pemuat naik asal (Domain Awam) melalui Wikimedia Commons